名侦探柯南」，其实并不好当。

作者 | Lilyann
编辑 | 靖宇

不久前，重新翻拍的《尼罗河上的惨案》（Death on the Nile）登陆国内院线。即便有「神奇女侠」盖亚·加朵和一众明星支持，影片还是遭到了阿加莎·克里斯蒂原著粉的疯狂吐槽，豆瓣评分目前 5.8 分——鉴于英国名导肯尼斯·布拉纳（同时饰演片中主角大侦探波洛）还会继续翻拍下去，该系列的评分可能还会继续走低。

从波洛、福尔摩斯再到各国影视剧，推理和探案故事在全球培养起了数亿的「业余侦探」。而现在，随着技术的发展，这些推理爱好者已经不满足于文艺作品，而想要「亲自上场」，用自己的力量侦破陈年遗案。

在美国，有人专门在 GoFundMe 和 Kickstarter 上众筹，对一些未侦破案件的证物和遗骸进行 DNA 检测，用来辨别遇害人以及犯罪嫌疑人身份。而针对这些来自推理爱好者的需求，甚至有名为 Othram 的公司，专门进行 DNA 分析比对鉴定，并且成功拿到了融资。

利用 DNA 技术「众筹擒凶」，会成为一种潮流吗？在推理爱好者的狂热背后，又有哪些阴暗面，会在意料之外，对人们和社会产生影响？

01 DNA「擒凶」

1959 年，年仅 9 岁的女童甘迪丝?罗杰斯（Candice Elaine Rogers）在华盛顿州斯波坎社区失踪，16 天过后，她的鞋子被两名猎人在山区发现，而后警方发现了她被埋在树下的遗体。

尸检报告显示，罗杰斯生前曾遭遇虐待，后被凶手勒死。由于失踪前她还在社区内兜售薄荷糖，所以又被称为「糖果」（Candy）。

由于证据始终不够确凿，警方始终难以被锁定嫌犯。警察曾将遇害者身上的体液进行检测分析，但遗憾的是，在联邦犯罪资料库中并没有找到能够与之吻合的对象。

半个多世纪以来，随着科技逐渐成熟，本地也成立了愈来愈多的 DNA 检测实验室。2020 年，警方曾与其中一家接洽，但得到的回信是样本年久腐坏，无法分析出更多的结果。

直到一年之后，法医科学家布列塔尼·赖特 (Brittany Wright) 与 Othram 实验室进行交谈得知，后者正在研发更为先进的基因测序技术：通过法医族谱学构建出凶手档案，缩小嫌犯人选至锁定目标到兄弟三人身上，其中一人便是真正的罪犯：约翰·霍夫（John Reigh Hoff）。

而推动整个案件水落石出的，是霍夫的女儿凯西·霍夫得知自己已在 30 年前自杀的父亲，和几十年前的悬案突然产生联系，主动与警方联络提供了自己的 DNA 样本。在搜索令获准下，警方挖掘霍夫的坟墓进行遗体采样，最后确认，霍夫即为 62 年前性侵并杀害女童的凶手。

而像小甘迪丝这样的案例，在美国还有很多。美国国家失踪与不明身份人口系统（NamUs）的数据，平均每年有超过 4 千具无名尸骸被发现，且每年遗骸与失踪人口的数量都在增加——美国国家司法研究所将其称之为「无声的巨大灾难」（silent mass disaster）。

让「无声灾难」不再「沉默」，是 Othram 这类的 DNA 实验室创办的初衷。实验室名称来自《指环王》中冈多主城——白城米纳斯·提力斯外的城墙，创始人 Mittelman 希望对基因进行测序、归档的技术手段，构建一个庞大的、可共享的数字化法医证据库（学界称为法医系谱学），破解积压疑案，从而成为守护社会的城墙。

设想很美好，但问题依旧存在。他们首先遇到的麻烦就是：DNA 样本过少怎么办？

其实从 1994 年，FBI 就已经开始建立 DNA 数据库了，名为 DNA 联合索引系统（Combined DNA Index System），将案件中的受害者与犯罪人员的 DNA 档案编入，从而能够快速抓获惯犯。但其中储存的样本数量与内容依旧不够详尽。

以 2020 年刚刚结案、Othram 也同样参与 DNA 化验的「休斯敦伴娘被新郎杀害」一案来说，一般的刑事案件会给出 20 个 DNA 注记作为对比，但在这个案子上至少从数据库中比对了几万个注记，越多的注记相符，能够确认的几率就越高。

由此，DNA 样本储存越多，一定程度上越能够推动案件进展。在这种条件下，「众筹」的模式就产生了。

这里的众筹衍生出两种意味：一是通过捐款，为 DNA 测序提供足够的基金，二是捐赠自己委托商业测序公司所测出的 DNA 信息到类似 Othram、GED Match 等机构的族谱数据库中。

而参与众筹的这个群体，往往就会被称之为「DNA 侦探」。

02「众筹破案」时代

去年，居住在迪拜的 Carla Davis，在 LinkedIn 上看到了 Othram 实验室发布的，关于「寻找 1978 年田纳西谋杀案凶手」的帖子，需要筹集到 5000 美元才能进行下一步的 DNA 测序。

Davis 被其中一句「我们是在为了正义众筹」所打动，直接补足了剩下未筹到的近 4,000 美元。根据纽约时报的报道：截至今年三月，这些 DNA 侦探们已经累计在众筹中捐赠了超过一百万美元。

在 Facebook 上，有人建立了「DNA Detectives Facebook」群组，聚集了许多与 Davis 有着相似追求的同好。这些人如此活跃的原因之一，是对「解谜快感」的追求。

对于犯罪事件的披露，一直以来都是人们好奇心最为高涨的议题之一。即使发生在距离遥远的其他国家，也难以抑制人们想要了解更多的冲动。

一起复杂而悬而未决的案件，能够同时戳中人们内心对作案动机的窥探欲、对受害者的共情力、伸张正义的使命感、以及对案件调查的参与欲。它们混合起来，成为同情、害怕、刺激，又带着些快感的情绪。

来自多伦多大学的学者 Jooyoung Lee 就曾提到，当我们开始消费这种「来自现实生活中的恐怖」，会让大家觉得自己成为了故事中的一部分。

而通过社交群组和 Othram 这类向大众开放捐款或捐赠 DNA 的基因实验室，让以众筹形式侦破悬案一事彻底变成可能。正如 Davis 在接受媒体采访时说的：「如果我们能够真的对于破案帮上忙，为什么还要仅仅呆在家里收听犯罪悬疑播客呢？」

法医界从业人士告诉极客公园（ID：geekpark），在国内，破案更多是依赖罪犯 DNA 数据库，将现场检材的 DNA 分型结果输入数据库对比，归属公安部管理。

而美国由于消费级基因检测市场的成熟，有需求的当事人（无论是寻根问祖或是侦破悬案）委托实验室发起众筹，逐渐形成公众的、可交叉共享的数据库。

不仅限于留有案底的罪犯，如果嫌疑人有亲属曾经向数据库提交过 DNA 采样，那么通过缩小范围的方式也能够定位。由此，「法医系谱学」应运而生。

03 伸张正义背后的「阴影」

当人们沉浸在冤案得雪，擒获凶手和伸张正义的满足背后，同样也有一些不可忽视的问题。

2018 年，基因监测机构 FamilyTreeDNA 宣布向执法部门开放，并且通过与调查人员合作，让警方能够使用的基因数量几乎翻了一倍，此举当时就引发了一轮对于身份隐私的担忧争议。次年，FamilyTreeDNA 正式就此事向公众道歉。

根据 FamilyTree 持有的 200 万人 DNA 数据，能够辨认出相关几乎数亿人的身份。这意味着，如果把控不严，这些掌握大量 DNA 数据的数据库，将会引发可怕的数据隐私问题。

萨拉劳伦斯学院（Sarah Lawrence College）的基因咨询师 Laura Hercher 曾经指出，应该由法律界定获取 DNA 信息的条件，而非机构本身。「（DNA）是抓捕罪犯的好方法，但也可能被别有用心的人滥用。」

通过 DNA 技术，可以追溯到一个人家庭谱系中的大多数亲人，而并不是所有人都想要自己的信息进入到这个系统之中。可惜的是，一旦有人上传了自己的 DNA 信息，与其相关的亲戚，也被动地进入到系统之中，其中的隐私和法律问题，目前还没有明确的解决方法。

不管是文艺作品，还是现实生活，在任何一起案件的侦破中，涉及的都不仅仅是犯罪者和受害者，更会影响到双方背后大量的关系人员。如何将先进的技术，控制在合理范围内，某种意义上要比破案更加重要。

参考资料

[1]Hoff's family proves crucial to helping solve murder, now live with fact family member committed brutal crimes | The Spokesman-Review

https://www.spokesman.com/stories/2021/nov/19/hoffs-family-proves-crucial-to-helping-solve-murde/

[2]NGS 为法医学带来变革

https://www.illumina.com.cn/company/news-center/feature-articles/revolutionizing-forensics-with-ngs.html

[3] 休士顿伴娘遭奸杀 25 年后揪出新郎是凶手

https://posts.careerengine.us/p/60a28d9b4087816230fef0e3

[4] 你就是侦探：真实犯罪案件为什么吸引我们？|界面新闻 · 影像

https://www.jiemian.com/article/3200114.html

[5]The Racial Composition of Forensic DNA Databases - California Law Review

https://www.californialawreview.org/print/racial-composition-forensic-dna-databases/

[6] 基因检测会暴露我们的隐私吗？_信息

https://www.sohu.com/a/319550815_119097

[7]The True Crime-Obsessed Philanthropists Paying to Catch Killers

https://www.nytimes.com/2022/03/27/technology/dna-tests-crime-solving.html

*头图来源：pixabay

本文为极客公园原创文章，转载请联系极客君微信 geekparkGO

它新生信分析过程中，会与很多不同格式的文件打交道，除了原始测序数据fastq之外，还需要准备基因组文件fasta格式和基因注释文件gtf格式。在分析的过程中还会有众多中间文件的生成，如bed、bed12、sam、bam、wig、bigwig、bedgraph等，生成后我们一般会查看下内容了解文件每一列的含义，以此来决定需要提取哪些有用信息列来进行下一步分析。

插播一个小剧场

老板：“先查看一下bam文件内容。”
小白：嗒嗒嗒敲键盘。

$ less ehbio.bam
"ehbio.bam" may be a binaryfile.  See it anyway?

小白：“哎呀，错了，应该这样。” 嗒嗒嗒敲键盘。

$ samtools view ehbio.bam # 回车一敲，灾难，电脑要卡死，赶紧按`control  + c`
$ samtools view ehbio.bam | less  # 这下终于可以查看了

老板：“你逗我呢……”（不失礼貌的批评）

刚接触生信分析的小白们这种尴尬的事情时有发生，为了帮助大家梳理这些剪不断理还乱的文件，本文以分析流程为主线，介绍各文件的格式以及有哪些常用命令来查看或处理它们。

1. 测序数据FASTQ文件

1）文件用途：样品测序返回的数据一般存储为fastq文件，通常是压缩文件filename.fq.gz的格式，节省存储空间和传输时间。NGS基础 - FASTQ格式解释和质量评估

2）查看方式

# zcat查看gzip压缩的文件
# head -n 8 显示前8行文件内容（前8行代表2条序列）

zcat filename.fq.gz | head -n 8

# @SRR1039521.13952745/1
# TTCCTTCCTCCTCTCCCTCCCTCCCTCCTTTCTTTCTTCCTGTGGTTTTTTCCTCTCTTCTTC
# +
# HIJIIJHGHHIJIIIJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJIIJJFIDHIBGHJIHHHHHHFFFFFFE

3）格式说明：fastq文件每4行代表一条序列
第一行：记录序列测序时所用仪器以及在测序通道中坐标信息，以@开头；
第二行：测序的序列信息，以ATCGN表示，由于荧光信号干扰无法判断是什么碱基时就用N表示；
第三行：通常一个+;
第四行：与第二行碱基信息一一对应，存储测序碱基的质量值。

4）其他常用命令

# 计算read数
# wc -l: 计算行数
# bc -l: 计算器 (-l：浮点运算)
# 为什么除以4，又除以1000000，计算的是million值

echo "`zcat trt_N061011_1.fq.gz | wc-l` / (4*1000000)" | bc -l

# 测序碱基数计算
zcat trt_N061011_1.fq.gz | awk'{if(FNR%4==0) base+=length}END{print base/10^9,"G";}'

awk的介绍见：常用和不太常用的awk命令

2.基因组FASTA文件

此文件可以从ensemble数据库下载的（https://www.ensembl.org/info/data/ftp/index.html）， 一般选择下载primary assemblyfasta（想知道为什么，点这里）。fasta文件用于序列存储，可以是DNA或蛋白序列，在此FASTA文件存储了基因组序列的信息。

序列名字行：以>符号开头，记录了该序列类型和所在基因组位置信息；

序列行（一行或多行）：序列信息，soft-masked基因组会把所有重复区和低复杂区的序列用小写字母标出的基因组，小写字母n表示未知碱基。

>1 dna_sm:chromosomechromosome:GRCh38:1:1:248956422:1 REF
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn
.....
ttgggctggggcctggccatgtgtatttttttaaatttccactgatgattttgctgcatg
gccggtgttgagaatgactgCGCAAATTTGCCGGATTTCCTTTGCTGTTCCTGCATGTAG
TTTAAACGAGATTGCCAGCACCGGGTATCATTCACCATTTTTCTTTTCGTTAACTTGCCG
.....
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn

# 通常要求序列名字行简单为好，而且一般加chr作为开头
# 给第一行添加chr标签，并去掉其他多余信息
# 下面的写法复杂了些，是为了避免给已经有chr信息的名字再加一次
# 帮助无脑操作
sed 's/^>\([^chr]\)/>chr\1/'  Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa |cut -f 1 -d ' ' > GRCh38.fa

3. 基因组注释文件gff和gtf

gff全称General featureformat，主要是用来注释基因组。gtf全称Gene transfer format，主要是用来对基因进行注释。两者均是一个9列的基因信息注释文件，前8列的信息几乎一样，区别在于第9列。具体可见历史推文NGS基础 - GTF/GFF文件格式解读和转换 在此不再赘述。

从ensemble下载的gtf文件前5行一般是以#开头的注释信息，后续分析中用不上需要去除，同时需要给第一列添加chr标签（与基因组序列一致），可通过下面的命令对文件进行加工：

# grep 匹配查询 -v 输出不匹配的行
gunzip Homo_sapiens.GRCh38.94.gtf.gz -c |grep -v '^#' | sed '/^[^chr]/ s/^/chr/' >GRCh38.gtf

4. bed文件

分析过程中的bed文件一般代表区域信息，如表示Peak位置的bed文件，表示基因注释的bed12文件。

• 表示基因注释时，gtf/gff和bed文件的区别

1）gtf/gff文件一行表示一个exon/CDS等子区域，多行联合表示一个gene；bed文件一行表示一个gene；
2）gtf文件中碱基位置定位方式是1-based，而bed中碱基定位方式是0-based，如下图所示。

• bed文件每一行对应信息
• 
  

必须包含的3列信息：
1）chrom：染色体名字 (e.g.chr3, chrY, chr2_random或者scaffold10671)。
2）chromStart：基因在染色体或scaffold上的起始位置（0-based）。
3）chromEnd：基因在染色体或scaffold上的终止位置 （前闭后开）。

可选的9列信息：
4）name：bed文件的行名。
5）score：本条基因在注释数据集文件中的评分（0-1000），在Genome Browser中会根据不同区段的评分显示对应的阴影强度（评分越高灰度越高）。
6）strand：链的方向+、-或. (.表示不确定链的方向)
7）thickStart：CDS区（编码区）的起始位置，即起始密码子的位置。
8）thickEnd：The endingposition at which the feature is drawn thickly (for example the stop codon ingene displays).
9）itemRgb：RGB颜色值（如：255,0,0），方便在GenomeBrowser中查看。
10）blockCount：bed行中外显子的数目。
11）blockSizes：逗号分割的列，数目与blockCount值对应，每个数表示对应外显子的碱基数。
12）blockStarts：逗号分割的列，数目与blockCount值对应，每个数表示对应外显子的起始位置（数值是相对ChromStart计算的）。

5. sam和bam文件

sam文件全称The SequencingAlignment/Map Format，是Alignment/Map步骤bwa/STAR/HISAT2等软件对结果的标准输出文件，用于存储reads比对到参考基因组的比对结果，是一个纯文本格式，文件一般较大。为了节省硬盘存储，一般使用其高效压缩的二进制格式bam文件。

利用samtools view的-b参数就能把sam文件转为bam文件。

1）sam文件查看方式
在linux终端直接用less即可进行查看；

2）bam文件查看方式
需要借助samtools view工具进行查看

samtools view filename.bam | less -S
samtools view -h filename.bam | less -S

NGS分析中大多数文件都是由header和record两部分组成，加上-h参数后可以将header显示出来，默认是不显示的。

@HD    VN:1.5  SO:coordinate
@SQ    SN:chr1 LN:248956422
@SQ    SN:chr10        LN:133797422
......
@SQ    SN:chrKI270392.1        LN:971
@SQ    SN:chrKI270394.1        LN:970
@RG    ID:BH_H3K27ac_2 LB:BH_H3K27ac_2 SM:BH_H3K27ac_2
@PG    ID:bwa  PN:bwa  VN:0.7.15-r1140 CL:bwa mem -M -t 8 -R@RG\tID:BH_H3K27ac_2\tLB:BH_H3K27ac_2\tSM:BH_H3K27ac_2\tPL: /MP
@PG    ID:MarkDuplicates      VN:1.138(aa51703435dc6a423013e74e56b0b68405facd79_1439324166)   CL:picard.sam.markduplicates.
K00141:244:HVL3NBBXX:8:2119:27235:3145399      chr1    10016  32      115M=10016   115     CCCTAACCCTAACCCTAACCC
K00141:244:HVL3NBBXX:8:2119:27235:31453147     chr1    10016  32      115M=10016   -115   CCCTTACCCTAACCCTAACCC

• header内容
  @HD：是必须的标准文件头，包含版本信息；
  @SQ：参考序列染色体名字和长度信息 (SN:scaffold name; LN: length)；
  @RG：重要read group信息，通常包含测序平台，测序文库和样本ID等信息，分析时用于区分不同样本（重测序时用到）；
  @PG：生成此文件的操作过程和参数信息 （program）。
• record内容
  每一行就是一条read比对上参考基因组的信息，总共12列，用tab键分割。

# 1. read名称；
# 2. 比对信息位flag值；
# 3. 参考序列染色体编号；
# 4. 5′端起始位置；
# 5. MAPQ：mapping quality，描述比对的质量，数字越大，特异性越高；
# 6. CIGAR字符串，记录插入、删除、错配等信息；
# 7. 配对read所比对到的染色体，仅双端测序的数据才有；
# 8. 配对read所比对到的位置，仅双端测序的数据才有；
# 9. 插入片段的长度，仅双端测序的数据才有；
# 10. read序列；
# 11. read质量值；
# 12. 12列以后的信息都是metadata，程序用标记

sam文件中第二列flag信息很重要，下面做进一步解释。

利用samtools flagstat工具可以查看bam文件中比对的flag信息，并输出比对的统计结果。

samtools flagstat *.bam

flag一共有12个标签，使用16进制数表示，每个标签值是2^(n-1)，其中n<=12，每个值有其对应的唯一解释含义，具体见下图。

你会发现随机挑选几个值做加和运算，他们的结果都是唯一的，所以在bam文件中第二列flag的值代表这条序列符合下图所示条件的值的和。

所以根据这个值我们可以判断这条序列是双端测序还是单端测序；如果是双端测序，reads来自左端还是右端。比如65 只能是1和64组成，代表这个序列是双端测序，而且是read1。

每次转换很头疼？别担心，网上有很多解码flag含义的在线工具，如SAM Format（网址：https://www.samformat.info/sam-format-flag）

输入flag的值，解析工具会返回匹配上的信息。如果是单端测序，flag值都是偶数。

如果是双端测序，工具会帮我们把另外一端序列的flag值返回，并且将这些数字情况大致分为5类，在右侧进一步显示这个值对应的含义。

6. wig、bigwig和bedgraph文件

上述bam和sam文件可以帮助我们探索reads在参考基因组中的比对情况，导入基因组浏览器查看比对状态和突变信息。而wiggle(简称wig)、bigwig(简写bw)以及bedgraph(简写bdg)只包含区域和区域的覆盖度信息，文件更小，用于可视化更方便，可以导入基因组浏览器（Genome Browser）中进行可视化，以查看reads在参考基因组各个区域的覆盖度并检测测序深度。这几个文件在ChIP-seq数据分析Call Peak阶段会生成，可以利用IGV等工具进行可视化，方便查看组蛋白修饰的程度。

• wiggle：展示区域的密度或强度信息，如GCpercent, probability scores, and transcriptome data.

variableStep chrom=chr2
300701 12.5
300702 12.5
300703 12.5
300704 12.5
300705 12.5

fixedStep chrom=chr3 start=400601 step=100span=5
11
22
33

• bedGraph: bed与wig的结合，更省空间和灵活，展示信息与wig类似。(bedGraph的格式一般有四列，Chr、start、end和value，并且坐标是以0为起始左闭右开)

chromA chromStartA  chromEndA  dataValueA
chromB chromStartB  chromEndB  dataValueB

• bigWig: wig文件的二进制压缩格式，可通过wigToBigWig工具转换

推荐大家阅读UCSC官网对这几个文件的详细解释：

• wiggle(WIG)：https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/wiggle.html
• bedGraph：https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/bedgraph.html
• bigWig：http://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/bigWig.html

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